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地(di)址：北京市(shi)朝阳(yang)区(qu)北苑路10号桑普大(da)厦2层
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基因编辑类型
根据研究(jiu)的(de)不同目(mu)的(de)，需(xu)要制备(bei)不同的(de)的(de)动物模(mo)(mo)型(xing)(xing)。当为了(le)研究(jiu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)功(gong)能时(shi)(shi)需(xu)要过表达或敲除(chu)相应基(ji)(ji)(ji)因(yin)。如果全身敲除(chu)目(mu)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)会导致动物死亡时(shi)(shi)，或需(xu)要在特(te)定的(de)组织(zhi)敲除(chu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)时(shi)(shi)，可以制备(bei)条(tiao)件(jian)敲除(chu)小(xiao)鼠。为了(le)建立基(ji)(ji)(ji)因(yin)突变模(mo)(mo)型(xing)(xing)时(shi)(shi)，制备(bei)点突变动物模(mo)(mo)型(xing)(xing)。制备(bei)基(ji)(ji)(ji)因(yin)人(ren)源化(hua)小(xiao)鼠时(shi)(shi)，可以进行人(ren)源基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)替换。制备(bei)不同的(de)动物模(mo)(mo)型(xing)(xing)，需(xu)采用(yong)相应的(de)策略，才(cai)能成功(gong)获得目(mu)标模(mo)(mo)型(xing)(xing)。
基因(yin)敲(qiao)(qiao)除(chu)(chu)是研究(jiu)基因(yin)功能的重要方(fang)法。传统(tong)ES打(da)靶敲(qiao)(qiao)除(chu)(chu)方(fang)法，周期(qi)长，费用(yong)高。CRISPR/Cas9在基因(yin)敲(qiao)(qiao)除(chu)(chu)方(fang)面的优(you)势：效率高，时间短，24天直(zhi)接获得(de)基因(yin)敲(qiao)(qiao)除(chu)(chu)小鼠。
技(ji)术一般的流程
设计合成gRNA→ 显微注射→ 小鼠出生(sheng)检测。
技术(shu)优势或适合应用的(de)研究
-效率高，可达90%的敲除效率，并且有一定纯合敲除比例。
-方便检测，从PCR条带的大小，容易区分是否发生敲除。
-时间短，24天获得基因敲除小鼠。
-不受敲除片段大小限制，从几十bp到Mb长度的DNA,都能有效敲除。
成功案(an)例(li)
图1：两个(ge)Grna切(qie)割位点之(zhi)间的(de)(de)~550bp基因序列被(bei)敲(qiao)(qiao)除，PCR检测(ce)，相(xiang)对于野(ye)生带773bp，发生敲(qiao)(qiao)除的(de)(de)鼠产生~220bp的(de)(de)条(tiao)带（箭(jian)头(tou)指向(xiang)的(de)(de)条(tiao)带）。
当基(ji)因(yin)敲除(chu)会(hui)导致小(xiao)鼠死亡(wang)时，需(xu)要(yao)条(tiao)(tiao)件(jian)敲除(chu)，才能获得(de)成体小(xiao)鼠用于研究。条(tiao)(tiao)件(jian)敲除(chu)一般使用Cre-loxp系统，其方法是在(zai)基(ji)因(yin)的(de)关键区域的(de)两侧，插入loxp。loxp小(xiao)鼠制备好后(hou)，与Cre小(xiao)鼠杂交，获得(de)loxp纯合，Cre阳性的(de)小(xiao)鼠，这种小(xiao)鼠在(zai)Cre的(de)作用下，loxp发生(sheng)重组，中(zhong)间的(de)序列被删除(chu)，达到(dao)敲除(chu)基(ji)因(yin)的(de)目的(de)。目前已经有(you)数百种Cre工具小(xiao)鼠，可(ke)以根据研究需(xu)要(yao)，购买或定(ding)制Cre工具鼠，在(zai)不同的(de)组织(zhi)器官，达到(dao)敲除(chu)目的(de)基(ji)因(yin)。Cre融(rong)合ER/ERT2后(hou)，可(ke)以使用tamoxifen调(diao)控Cre入核，实现时间上的(de)调(diao)控删除(chu)。
图1：通过CRISPR辅(fu)助，在(zai)关键外(wai)(wai)显(xian)子(zi)的两侧通过同(tong)源重组(zu)，插入(ru)两个loxp，在(zai)Cre的作用下，loxp之间的外(wai)(wai)显(xian)子(zi)被删除，实现(xian)基因条件敲(qiao)除。
技术(shu)一般的流程
打靶(ba)(ba)载体(ti)设计→ 载体(ti)构建(jian)→ 显(xian)微(wei)注射(EPS打靶(ba)(ba))→ 小鼠鉴定。
技术(shu)优(you)势或适(shi)合应用的研究
-用于敲除致死的基因
-非致死基因，用条件敲除也可以在不同的组织，不同的时间敲除基因，获得更多的实验数据。
成功案例
图2：在关键外(wai)显子(zi)(zi)或(huo)非3整数(shu)倍的外(wai)显子(zi)(zi)两侧敲入loxp,在Cre的作用下，该(gai)区域被删(shan)除，导(dao)致基因敲除。
图3：设计Loxp插(cha)入位(wei)点(dian)的(de)特(te)异引物(wu)与同源臂外(wai)侧(ce)的(de)引物(wu)，通过PCR，可以(yi)检(jian)测到(dao)两个loxp被正确(que)敲入到(dao)目的(de)位(wei)置(zhi)，证明获得条件敲除小鼠。
随机(ji)转基(ji)因是一(yi)种经(jing)典的(de)过表(biao)达基(ji)因小(xiao)鼠制备策略，不同(tong)于(yu)靶向基(ji)因编辑，没(mei)有受(shou)到新兴(xing)基(ji)因编辑技术的(de)影响(xiang)。该方法通过将基(ji)因随机(ji)整合到基(ji)因组中，实现目的(de)基(ji)因过表(biao)达。
技术一般的流程
过表(biao)达载(zai)体构(gou)建→ 显微(wei)注射→ 小(xiao)鼠鉴定(ding)筛选→ 表(biao)达检测→ 品(pin)系(xi)建立。
图(tu)1：转(zhuan)基因载体和小鼠制(zhi)备流程。
技(ji)术优势或(huo)适合应(ying)用的研究
-可以广谱，或组织特异过表达目的基因。
-多拷贝插入，比定点插入表达量更高。
-受整合位置影响，可能表达沉默，或者表达谱错误。
成功案例
图2：通过转基(ji)因载体特异的引物设计，检测到转基(ji)因阳性(xing)的小鼠，一般效率在10-20%。
定点(dian)(dian)(dian)转基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)是(shi)(shi)将(jiang)转基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)达(da)(da)载(zai)体敲入到Rosa26位点(dian)(dian)(dian)，该位点(dian)(dian)(dian)被证明是(shi)(shi)在(zai)所(suo)有组织细胞都(dou)活(huo)跃的(de)(de)区域，不会发生随(sui)机转基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)中(zhong)出现的(de)(de)转基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)沉默的(de)(de)现象。常用来制作过表(biao)达(da)(da)或(huo)条(tiao)件过表(biao)达(da)(da)小(xiao)鼠。条(tiao)件过表(biao)达(da)(da)是(shi)(shi)在(zai)目(mu)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)前面插入loxp包围(wei)的(de)(de)Stop序列(lie)，阻止(zhi)目(mu)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)达(da)(da)。该小(xiao)鼠模型与Cre小(xiao)鼠杂交，能够在(zai)Cre表(biao)达(da)(da)的(de)(de)组织中(zhong)，删除Stop序列(lie)，从(cong)而使目(mu)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)发生表(biao)达(da)(da)；过表(biao)达(da)(da)小(xiao)鼠直接获得组成性(xing)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)达(da)(da)小(xiao)鼠。维通(tong)达(da)(da)的(de)(de)Rosa26位点(dian)(dian)(dian)的(de)(de)定点(dian)(dian)(dian)转基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)系统(tong)，已(yi)经实现长达(da)(da)10kb的(de)(de)定点(dian)(dian)(dian)转基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。
图1：Rosa26位置敲入(ru)转基因表达载体(ti)，制备定点转基因小(xiao)鼠(shu).
基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)敲入是(shi)指在基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)组的(de)特定位置插(cha)入一段DNA序列，例(li)如给基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)加GFP荧(ying)光标签标记蛋白，原位敲入制(zhi)备(bei)Cre工(gong)具鼠等应用。1kb以下(xia)的(de)小片段插(cha)入，CRISPR/Cas9效(xiao)率(lv)较高。对于(yu)大(da)片段的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)插(cha)入，需要使用ES，或者EPS制(zhi)备(bei)策略(lve)才能保(bao)证(zheng)项目周(zhou)期(qi)和效(xiao)率(lv)。
图1：把绿色(se)荧(ying)光蛋白敲入目的基因(yin)的C端，融合(he)表达，示踪目的基因(yin)。
技术一般(ban)的(de)流程+图解
打靶载体(ti)设计→ 载体(ti)构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势(shi)或(huo)适合应用的研究
-CRISPR用于小片(pian)段的基(ji)因敲入。
-ES/EPS用于大(da)片段(duan)基因敲入。
-给基因(yin)加各种标签，原位敲入制(zhi)备(bei)Cre工具鼠(shu)。
基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)替换指，根(gen)据研(yan)究(jiu)需要(yao)(yao)，将小(xiao)鼠的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)替换为其(qi)它物种的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。可以(yi)将基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)部分功能(neng)区，或者全基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)进行替换。1kb以(yi)下的(de)小(xiao)片(pian)段替换，可以(yi)采用(yong)CRISPR/Cas9策略(lve)。对于大片(pian)段的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)替换，需要(yao)(yao)使用(yong)ES，或者EPS制(zhi)备策略(lve)才(cai)能(neng)成功。
图1：用其它种系的(de)基(ji)因，替换小鼠的(de)基(ji)因片段。
技术一般的流程+图解(jie)
打(da)靶载(zai)体设计→ 载(zai)体构建→ 显微注射(EPS打(da)靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或(huo)适合应(ying)用(yong)的研究
-CRISPR用于小(xiao)片段(duan)的基因替换。
-ES/EPS用于大片段基因(yin)替换(huan)。
3)基(ji)因人源化(hua)小鼠的(de)制备，如PD1等免(mian)疫检查点(dian)人源化(hua)小鼠的(de)制备。
图1 EPS小(xiao)片段敲入效率(lv)高达(da)90%。
图2 EPS系统对于长达(da)20kb的(de)大片(pian)段(duan)敲入，也具有很高的(de)效率。
许多疾病由(you)氨基酸突(tu)(tu)变(bian)引起，为了构(gou)建此类疾病模(mo)型(xing)，可以将小鼠的(de)对应基因的(de)位点(dian)进(jin)行突(tu)(tu)变(bian)。单链DNA在点(dian)突(tu)(tu)变(bian)方面有(you)较高的(de)成功率。
图1 单链DNA模板制备点(dian)突(tu)变小(xiao)鼠。
图(tu)2 PCR扩(kuo)增(zeng)包含(han)突变位点(dian)的序(xu)列，测序(xu)检测发生点(dian)突变的小鼠，目标(biao)碱基(ji)出现套峰(feng)，证(zheng)明获得杂合突变小鼠。
技(ji)术一般的流程
gRNA设计(ji)→ 供体DNA合成→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合应用的研(yan)究(jiu)
-氨基酸突变类小鼠疾病模型模拟
-CRISPR点突变效率相对较高
